Резюме. Использование регенеративной медицины в целях лечения нарушений центральной нервной системы человека десятилетиями ограничивалось научно-методологическими и этическими барьерами. Прежде всего эти препятствия стояли на пути развития трансплантационно-терапевтических подходов с использованием стволовых клеток. Революционное исследование Яманаки в 2006 году стимулировало поиск эффективных путей преобразования дифференцированных соматических клеток млекопитающих в клетки необходимых типов, в том числе в нейроны. Определение комплексов низкомолекулярных соединений, способных обеспечить перепрограммирование соматической клетки с использованием и без использования транскрипционных факторов, позволило существенно повысить эффективность перепрограммирования. В этой статье предлагается краткий обзор актуальных работ по культивированию индуцированных нейронов с использованием низкомолекулярных соединений.
Ключевые слова: перепрограммирование соматических клеток, перепрограммирование с помощью низкомолекулярных соединений, химически индуцированные нейроны.
Біологічні науки
УДК: 606:616.8
Депутатова Тетяна Олегівна
De Novo
Керівник відділу
Депутатова Татьяна Олеговна
De Novo
Руководитель отдела
Tatyana Deputatova
De Novo
Head of Department
ПЕРЕПРОГРАМУВАННЯ СОМАТИЧНИХ КЛІТИН З УТВОРЕННЯМ НЕЙРОНІВ З ДОПОМОГОЮ НИЗЬКОМОЛЕКУЛЯРНИХ СПОЛУК
ПЕРЕПРОГРАММИРОВАНИЕ СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК С ОБРАЗОВАНИЕМ НЕЙРОНОВ ПОСРЕДСТВОМ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ СОЕДИНЕНИЙ
REPROGRAMMING OF SOMATIC CELLS TO NEURONS WITH SMALL MOLECULES
Резюме. Застосування регенеративної медицини задля лікування розладів і порушень центральної нервової системи людини десятиріччями обмежувалися науково-методологічними й етичними бар’єрами. Передусім ці перешкоди заважали розвитку трансплантаційно-терапевтичних підходів з використанням стовбурових клітин. Революційне дослідження японських вчених на чолі з Яманакою у 2006 році стимулювало пошук ефективних шляхів з перетворення диференційованих соматичних клітин ссавців на клітини потрібних типів, у тому числі на нейрони. Встановлення комплексів низькомолекулярних сполук, що здатні забезпечити перепрограмування соматичної клітини із застосуванням та без застосування транскрипційних факторів, дозволило суттєво підвищити ефективність перепрограмування. У цій статті пропонується стислий огляд актуальних робіт з культивування індукованих нейронів завдяки застосуванню низькомолекулярних сполук.
Ключові слова: перепрограмування соматичних клітин, перепрограмування з допомогою низькомолекулярних сполук, хімічно індуковані нейрони.
Резюме. Использование регенеративной медицины в целях лечения нарушений центральной нервной системы человека десятилетиями ограничивалось научно-методологическими и этическими барьерами. Прежде всего эти препятствия стояли на пути развития трансплантационно-терапевтических подходов с использованием стволовых клеток. Революционное исследование Яманаки в 2006 году стимулировало поиск эффективных путей преобразования дифференцированных соматических клеток млекопитающих в клетки необходимых типов, в том числе в нейроны. Определение комплексов низкомолекулярных соединений, способных обеспечить перепрограммирование соматической клетки с использованием и без использования транскрипционных факторов, позволило существенно повысить эффективность перепрограммирования. В этой статье предлагается краткий обзор актуальных работ по культивированию индуцированных нейронов с использованием низкомолекулярных соединений.
Ключевые слова: перепрограммирование соматических клеток, перепрограммирование с помощью низкомолекулярных соединений, химически индуцированные нейроны.
Summary. Regenerative medicine faced scientific, methodological and ethical barriers in therapeutic treatment of human CNS diseases for decades. First of all the barriers limited the development of stem cell based transplantation therapeutic approaches. In 2006 the breakthrough study of Yamanaka and colleagues encouraged search for effective means to convert differentiated somatic cells of mammals into targeted cell types, including neurons. Small molecules cocktails were found to enable reprogramming of somatic cells with and without ectopic expression of transcriptional factors and enhance reprogramming efficiency. Here we offer a review of the latest studies reporting induction of neurons with small molecules.
Key words: reprogramming of somatic cells, reprogramming with small molecules, chemically induced neurons.
Вступ. Процес утворення нейронів у дорослому організмі ссавців є спрямованим передусім на підтримання нормального функціонування нервової системи та не може задовольнити потребу у регенерації нервової тканини, що виникає у випадках травм і пошкоджень мозку. У зв’язку з цим дослідження у сферах регенеративної медицини, а також моделювання порушень роботи центральної нервової системи наразі сфокусовано на пошуку ефективних шляхів культивування пацієнтоспецифічних функціональних нервових клітин різних типів [3; 7; 12; 13; 17-22].
Поштовх для нових досліджень дало явище перепрограмування диференційованих соматичних клітин, що було здійснено групою науковців на чолі з Яманакою з допомогою чотирьох транскрипційних факторів (ТФ) [23; 29]. У 2006 році ці японські вчені опублікували працю про успішне перетворення (перепрограмування) фібробластів шкіри миші на плюрипотентні стовбурові клітини. Отримані науковцями індуковані стовбурові клітини було визначено як плюрипотентні, оскільки вони мали здатність до диференціації у будь-які типи клітин, за винятком трофектодерми, клітин позазародкових органів (плацента, жовтковий мішок) [6]. Відповідно, винайдена у 2006 році технологія перепрограмування та індукції плюрипотентності відкривала нове джерело для культивування пацієнтоспецифічних клітин, у т.ч. нейронів.
Подальші розробки у сфері перепрограмування соматичних клітин стимулювалися питаннями безпеки, що їх викликало застосування ретровірусних векторів та онкогенних транскрипційних факторів через можливість реактивації вірусів та розвиток пухлинних захворювань, та намаганнями підвищити ефективність процесу перепрограмування [16; 26- 28; 34]. Новітні дослідження з використанням низькомолекулярних сполук (або ж малих молекул) є багатообіцяючим напрямком розвитку технології перепрограмування, оскільки пропонують більш швидкий та безпечний шлях конверсії диференційованих клітин з одного типу на інший, зокрема на нейрони [1; 5; 11; 14; 32].
Нейрони, культивовані з допомогою низькомолекулярних комплексів. Характеристики
Низькомолекулярні сполуки (біологічно активні речовини з молекулярною вагою <900 дальтон) визначаються здатністю впливати на біологічні процеси. У 2015 році одразу дві дослідницькі групи з Китая на чолі з Лі та Ху повідомили про перепрограмування фібробластів на нейрони з допомогою низькомолекулярних сполук – хімічну індукцію нейронів [14; 15; 11]. Індуковані нейрони, що дослідники отримали у ході експериментальних робіт, визначалися низкою властивостей, притаманних нервовим клітинам. Зокрема, індуковані нейрони мали властиву нервовим клітинам морфологію, потенціал-залежні іонні канали, здатність до утворення спайків і формування синапсів тощо. Фахівці на чолі з Ху застосували методики флуоресцентної мікроскопії та оптичних спостережень внутрішньоклітинних процесів (зокрема кальцієвої візуалізації), щоб підтвердити активність значної частини індукованих нейронів. Дослідження профіля експресії генів у і) фібробластах, іі) хімічно індукованих нейронах (хіН), ііі) нейронах, що їх було культивовано зі стовбурових клітин, іv) нервових клітин, отриманих шляхом перепрограмування з використанням ТФ, також засвідчили подібність хіН до нервових клітин, отриманих за допомогою зазначених технологій культивування. З іншого боку, хімічно індуковані нейрони характеризувалися суттєвими генетичними, а також морфологічними відмінностями порівняно з фібробластами [1; 11; 14].
Щоб детальніше вивчити перебіг процесу перепрограмування, фахівці на чолі з Лі провели РНК-секвенування клітин через 48 годин та 19 днів після впливу низькомолекулярним комплексом (про складові комплексу див. докладніше у наступній частині статті) на перепрограмовані фібробласти. Ієрархічна кластерізація отриманих даних вказала, що за глобальним профілем експресії генів хімічно індуковані нейрони були відмінними від фібробластів та не експресували типові для фібробластів гени.
Власне механізми перебігу перепрограмування соматичних клітин на нейрони потребують подальшого вивчення. Однак у згаданих працях повідомляється про індукцію нейронів, що відбувається без стадії утворення попередників нервових клітин. Адже обидві групи вчених не спостерігали експресії генів, властивих попередникам нейронів, що вказує на безпосереднє перепрограмування на нервові клітини [1].
Індукція нейронів з допомогою низькомолекулярних комплексів, встановлених у 2014-2015 рр.
Фахівці лабораторії Денга визначили комплекс низькомолекулярних сполук, що забезпечував ефективне перепрограмування фібробластів миші та появу у них властивостей нервових клітин [14]. Щоб визначити, які саме низькомолекулярні сполуки можуть забезпечити індукцію перепрограмування на нейрони, було застосовано скринінгові дослідження. На початку дослідження було встановлено, що три ТФ – Ascl1, Brn2 та Myt1l (дані ТФ відіграють вирішальну роль у формуванні нервової трубки підчас раннього ембріонального розвитку ссавців та диференціації нервових клітин), здатні індукувати перепрограмування мишачих фібробластів на нейрони. Причому вирішальну роль у цьому процесі відіграє Ascl1, тоді як Brn2 та Myt1l покращують ефективність перепрограмування та є підтримуючими факторами. Також було виявлено, Ascl1 з низькою ефективністю може індукувати утворення нервових клітин навіть без двох інших ТФ [25].
Після проведення скринінгу приблизно 5000 низькомолекулярних сполук, що забезпечують зумовлене Ascl1 перепрограмування клітин, було виявлено комплекс FICS [14; 2]. Даний комплекс включав:
Подальший аналіз низькомолекулярних сполук дозволив визначити, що застосування I-BET151 (інгібітор білків ВЕТ, корегуляторів транскрипції, що пригнічує експресію притаманних фібробластам генів) значно підвищує рівень ефективності перепрограмування. Відповідно, було визначено комплекс FICSВ як ефективний засіб обумовленого Ascl1 перепрограмування мишачих фібробластів на незрілі нейрони [14]. Винайдені за результатами досліджень низькомолекулярні комплекси впливають на сигнальні шляхи, що відіграють вагому роль у спрямованій нейрональній диференцації in vitro та навіть у розвитку нервової системи in vivo. Так, наприклад, згаданий вище CHIR99021 стимулює утворення нервових клітин з плюрипотентних стовбурових клітин за перепрограмування під впливом ТФ [2; 4].
У 2015 році китайські спеціалісти вперше повідомили про пряме перепрограмування фібробластів людини на нервові клітини за допомогою комплексу з семи низькомолекулярних сполук VCRFSGY. Дослідники поінформували, що здійснили перепрограмування фібробластів людини на нейрони з допомогою попередньо встановленого комплексу VCR (V, вальпроєва кислота; С, CHIR99021, інгібітор кінази глікогенсинтази 3; R, Repsox, інгібітор сигнальних шляхів трансформуючого фактору роста β) та чотирьох додаткових низькомолекулярних сполук. Цими додатковими сполуками були Forskolin (F, активатор циклічного аденозинмонофосфату), SP600125 (S, інгібітор c-Jun-N-термінальної кінази), GO6983 (G, інгібітор протеїнкінази С) та Y-27632 (Y, інгібітор кінази з родини серин-треонінових протеїнкіназ) [11]. Застосування цих чотирьох речовин зумовлювалося їх наступними властивостями.
Електрофізіологічні властивості нейронів, індукованих з фібробластів під дією винайденого комплексу VCRFSGY, мали притаманний нервовим клітинам профіль експресії генів та майже не експресували властиві фібробластам гени. У подальшому цей підхід успішно використовувався для хімічної індукції нейронів пацієнтів зі спадковою хворобою Альцгеймера та подальшого моделювання цього захворювання з урахуванням генетичних особливостей пацієнтів, а також дослідження потенційних засобів гальмування нейродегенеративних процесів [11].
Автори також повідомляли, що хімічна індукція нейронів супроводжувалася інактивацією генів, специфічних для фібробластів, та підвищенням експресії ендогенних ТФ нейронів. Ці дані відповідали результатам попередніх досліджень щодо можливості перепрограмування соматичних клітин миші та людини на нейрони завдяки посиленій експресії окремих ТФ, притаманних нервовим клітинам. Отже, комплекс VCRFSGY забезпечує припинення притаманної фібробластам експресії генів, специфічно підвищує експресію генів, відповідальних за фенотип нервових клітин, та уможливлює конверсію фібробластів у нейрони.
Нещодавно група науковців на чолі з Жангом повідомила, що з допомогою комплексу низькомолекулярних сполук можна перепрограмувати астроцити людини на функціональні нейрони in vitro. А саме послідовний вплив низькомолекулярними комплексом, що у т.ч. включає інгібітор кісткового морфогенетичного білка LDN193189, інгібітор активін-рецептороподібної кінази 5 SB431542, інгібітор кінази з родини серин-треонінових протеїнкіназ Тіазовівін (Thiazovivin), інгібітор кінази глікогенсинтази 3 CHIR99021, вальпроєву кислоту й інгібітор рецептор-залежного латентного фактора транскрипції DAPT, забезпечує перепрограмування астроцитів на функціональні нейрони впродовж 8-10 днів. Після пересадки до мишачого мозку індуковані нейрони лишалися функціональними понад одного місяця та долучилися до локальних нейрональних мереж. Подальші дослідження процесів перепрограмування надаватимуть можливість відкриття інноваційних підходів у фармакотерапії з регенерації нервових клітин [31-32].
Висновки. Перетворення однієї соматичної клітини на клітину необхідного типу досягається завдяки ектопічній, тобто не притаманній клітині у нормі, експресії транскрипційних факторів або ж низькомолекулярних сполук. Технологія перепрограмування клітин з допомогою низькомолекулярних сполук відкриває швидкий і зручний шлях до отримання пацієнтоспецифічних клітин потрібних типів. Хімічна індукція перепрограмування дозволяє перетворювати клітини, що легко отримувати (наприклад, фібробласти шкіри), на аутогенні клітини необхідного типу. Роботи дослідницьких груп США та Китаю 2014-2016 рр. доводять перспективність суто хімічного перепрограмування соматичних клітин і культивування нейронів – завдяки застосуванню низькомолекулярних сполук та без транскрипційних факторів. Важливим джерелом даних для розробки низькомолекулярних комплексів перепрограмування клітин є вивчення сигнальних шляхів, пов’язаних з розвитком клітини.
Подальші дослідження з перепрограмування соматичних клітин і хімічної індукції перепрограмування потребують фокусу на з’ясуванні механізмів процесів трансдиференціації соматичних клітин ссавців, а також на створенні безпечних і зручних підходів до перепрограмування соматичних клітин. Ефективне культивування нейронів різних типів належить до нагальних векторів сучасних розробок із застосуванням низькомолекулярних сполук.
Література
